羊臟器組織中性粒細胞分離液KIT說明書

本品用于分離羊臟器組織中性粒細胞
技術(shù)文檔編號：TBD0035SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】

200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

 名稱 產(chǎn)品編號 規(guī)格
   
A 分離液 1  200ml
   
B 試劑 F（贈品） F2013TBD 200ml
   
C 樣本稀釋液（贈品） 2010C1119 200ml
   
D 清洗液（贈品） 2010X1118 200ml
   
E 紅細胞裂解液（贈品） NH4CL2009 100ml
   
F 說明書  1 份
   

【實驗前準備】

適用儀器：最大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機

【檢驗方法】

全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。

1.首先制備組織單細胞懸液，制備方法詳見“組織單細胞懸液制備技術(shù)”。

2.取一支 15ml 離心管，依次加入分離液 1。

3.用吸管小心吸取細胞懸液樣本加于分離液之液面上，400-650g ，離心 20-30min（注：如改變樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力及離心時間，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。

4.離心后，離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細胞層，上層細胞為單個核細胞層，下層細胞為中性粒細胞層。

5.用吸管小心吸取分離液中的中性粒細胞層，如有紅細胞混雜則加入適量紅細胞裂解液（產(chǎn)品編號：NH4CL2009）將紅細胞裂解（具體方法見“紅細胞裂解液使用說明”）即得目的細胞。

6.將獲得的細胞層移至另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：

2010X1118），混勻細胞。
7.250g，離心 10min。

8.棄上清。

9.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

10.250g，離心 10min。

11.重復 8、9、10，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

分離圖例





















【注意事項】

1.全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結(jié)果，需在取樣 2h 內(nèi)進行實驗。

2.本實驗最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。

3.分離液用量大于組織單細胞懸液樣本量時，分離效果更佳。

4.如實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助.

【儲存條件及有效期】

常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】

本實驗中性粒細胞提取率大于 80%。

 下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當進行參考。
       
  紅細胞  白細胞   血小板
       
   （4.0-10.0）×109  
 含量（個/L） （4.0-5.5）×1012 中性粒細胞 淋巴細胞  單核細胞 （1.0-3.0）×1011
   50%-70% 20%-40%  3%-8%  
        
 【相關(guān)實驗技術(shù)方案】      

1.組織單細胞懸液制備技術(shù)。

2.所獲得中性粒細胞的培養(yǎng)技術(shù)。

3.所獲得中性粒細胞的核酸提取技術(shù)。

4.所獲得中性粒細胞的鑒定方法A.流式細胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

出現(xiàn)情況 出現(xiàn)原因 建議解決方案
  
離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 適當增減轉(zhuǎn)速
  
離心后目的細胞存在于分離液中 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 
  
  
離心后白環(huán)層彌散 細胞密度過大 調(diào)整細胞密度
  
離心后白環(huán)層太淺或看不見 細胞密度過小 
  
  

2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。

3.本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到最佳分離效果，離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。